Cycleave® PCR O-157 (VT gene) Screening Kit Ver.2.0

Cycleave® PCR O-157 (VT gene) Screening Kit Ver.2.0
品牌	Code No.	包装量	价格	说明书
Takara	CY217Q	20 次	960 元
Takara	CY217A	50 次	2,000 元
Takara	CY217B(A × 2)	100 次	3,600 元

制品内容 (Code No.: CY217A 25 μl反应×50 次量)

1. 2×Cycleave Reaction Mixture (2×conc.)	625 μl
2. VT Primer / Probe Mix (FAM、ROX) (5×conc.)*	250 μl
3. dH2O	1 ml
4. NaOH Solution (50 mM)	1.5 ml×4
5. Tris-HCl Buffer pH7.0 (1 M)	500 μl×2
6. dH2O (for Dilution)	1 ml
7. VT1 Positive Control	150 μl (30次反应量)
8. VT2 Positive Control	150 μl (30次反应量)
* 含有荧光标记探针，应避光保存。Primer由岛津制作所制造。能检测VT1基因和VT2基因 (VT2、VT2vha、VT2vhb、VT2vp1)，目的基因扩增片段大小为171 bp。组分1、2、3存放在本试剂盒做中附带的一个small盒子中，与4-8组分分开保存。

制品说明

以O-157：H7 (Enterohemorrhagic Escherichia coli，HEC) 为代表的肠出血性大肠埃希氏菌 (EHEC) 是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科埃希氏菌。其发病症状是血便并伴有剧烈腹痛、严重时引发溶血性尿毒综合症。产生这些症状的主要原因是肠出血性大肠埃希氏菌 (EHEC) 能产生一种被称作Vero毒素 (Verotoxin) 的细胞毒素。能够快速准确地检测Vero毒素基因对于EHEC的检测和鉴定极其重要。
本制品是使用Real Time PCR方法对以O-157∶H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌 (EHEC) 引起食物中毒的Vero毒素基因VT1型、VT2型进行检测的试剂盒。PCR法是以微量DNA为模板，对目的基因片段进行扩增，通过DNA的热变性、引物退火及DNA聚合酶的延伸3个步骤作为一个循环，经过多次循环可在短时间内使目的片段扩增100万倍。利用荧光标记探针法或荧光染料嵌合法进行实时监测的方法为实时荧光定量PCR。
制品中DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，可以有效地抑制在配制反应液时发生的引物错配及引物二聚体引起的非特异性PCR扩增，大大提高PCR的检测灵敏度。 本制品采用Cycling Probe法进行检测，Cycling Probe法是由RNA和DNA构成的杂合探针与RNase H组合使用的高灵敏度检出法，能够高效率地检出扩增过程中及扩增结束时的目的基因片段。Cycling Probe内部含有RNA碱基，一端标记荧光物质，另一端标记荧光淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。 
制品中VT1基因和VT2基因检测用FAM标记，内参照 (Internal Control) 检测用ROX标记探针。在同一反应管内可以对Vero毒素VT1、VT2基因及内参照同时进行扩增，通过两种不同荧光标记的探针可以对VT1基因和VT2基因及内参照同时检出。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。本检测无需电泳，简单快速，灵敏度高，特异性好。
本制品对反应组份进行了Premix化，并增加了样品处理 (碱变性提取) 时所需试剂，整体操作简单，快速。但本试剂盒不能进行VT1基因和VT2基因分型。

保存

运输及保存：-20℃
注意：组份1～3和组份4～8分别存放，并于-20℃保存。

操作注意事项

1. 请按照Real Time PCR扩增仪的使用说明书进行操作。
2. 如果杂合探针、引物因混入核酸酶而被降解，则不能准确进行检测。实验者的汗液和唾液含有核酸酶，操作时应注意。
3. 判断为阳性的样品，要用微生物学方法进行再确认。
4. PCR反应是灵敏度非常高的反应。为防止污染，建议从反应液的配制到检测的实验过程中，设定以下 3个实验区域，并进行物理性隔离。
    区域1：反应液的配制及分装。
    区域2：检测样品的制备。
    区域3：向反应液中添加检测样品，进行反应、检出。 
    由于本制品使用Real Time PCR法，扩增反应与检测同时进行，反应后的扩增产物不需要再进行电泳。为了避免污染，严禁从Tube管中取出扩增产物。 
5. 本制品是使用Real Time PCR扩增仪对结果进行分析、判定。当Real Time PCR扩增仪的Auto功能不适合时，将会导致结果判定错误。此时可参照Real Time PCR扩增仪说明书进行手动设定。